多光子显微镜阅读

作者：Maura Francis, Cory Boone, Jaclyn Wycoff

多光子（非线性）显微技术相比<381>传统共聚焦显微技术</381>，能显著降低光漂白和光毒性，是获取高分辨率三维(3D)图像的理想选择。该技术因其先进的光学切片能力（无离焦吸收）成为活体厚样本分析的首选方法。

多光子显微术作为荧光显微技术的分支，采用与常规<384>宽场荧光显微术</384>相似的成像原理，通过多种荧光标记物（荧光团）区分活细胞或组织中的结构。当激光波长能量足够时，可激发荧光团发射成像信号光。传统技术中仅需单个光子即可激发荧光团。离焦荧光在标准荧光显微镜中常导致问题，因其来自其他平面的荧光会干扰焦平面成像。传统共聚焦显微镜通过在探测器前设置针孔阻挡离焦光来解决此问题。然而该技术不适用于厚样本成像，由于存在散射和吸收问题。成像质量在约100µm厚度开始下降，但对某些样本可保持至700µm<387>1</387>。

如其名称所示，多光子显微术中多个光子被同时吸收以激发荧光团。激发光被限制在极小的三维空间内(<390>图1</390>)，因此相比传统共聚焦显微镜散射更少。散射光强度与波长的四次方成反比。传统技术使用紫外(UV)或可见光，其散射远高于红外光。多光子显微镜常用的红外波长因其更低的散射和吸收，可实现更深的样本穿透<393>2</393>。

图1：多光子显微技术产生的激发光作用区域相比单光子技术显著缩小。

就仪器而言，多光子显微镜和共聚焦显微镜几乎完全相同，但多光子显微镜使用的是超快激光，如飞秒激光。超快激光器峰值功率高，脉冲持续时间短，这两者都是激发荧光团所必需的。其中许多激光器在近红外到红外区域发射，具有高重复率，这在生物、活体样本中已被证明是有益的。³高功率峰值可实现更高的成像分辨率，并有助于减少散射。与共聚焦显微镜不同，多光子显微镜不需要针孔，因为三维限制的激发体积会大大减少离焦荧光。

工作原理

为获得最大组织穿透深度，有时会在被检测对象中植入观察窗。光在组织中的穿透深度通常限制在1-2毫米。使用红外（IR）激光器（如钛蓝宝石激光器）可以减少光散射并增加穿透深度<403>4</403>。长波长光子比短波长光子能量低，因此需要多个红外光子共同激发单个荧光团至高能态(<406>图2</406>)。如果某荧光团通常需要350纳米波长的光子激发，那么在双光子显微镜中，该荧光团可以被两个700纳米波长的光子激发。同样的原理适用于三光子显微镜，只是需要三个波长为单光子吸收所需波长三倍的光子来激发荧光团。多个光子要共同参与单个激发过程，它们之间的时间间隔必须极短。这就是为什么需要具有短脉冲持续时间和高重复率的超快激光器。

使用近红外波长的额外好处是，它们允许重复成像，并且比紫外波长散射更少，后者还可能导致严重的光漂白。多光子显微镜克服了基于紫外激发的技术的一些缺点，使用户能够更深入地观察样本<409>4</409>。紫外波长还会对生物样本造成更多的光损伤。

图2：在单光子吸收(A)中，单个紫外(UV)光子被吸收产生荧光。多光子显微技术采用双光子(B)或三光子(C)吸收机制，通过同时吸收多个光子来产生荧光。

当多个光子的总能量同时达到荧光团基态激发所需的跃迁能级时，就会发生多光子激发。根据技术类型（双光子或三光子显微镜），荧光团会同时吸收两个或三个光子。吸收率与激发光强度的平方成正比，因此双/三光子吸收只发生在系统焦点处（光子密度最高区域）。这一特性既避免了离焦荧光干扰成像，又无需使用针孔，这是多光子显微镜与传统共聚焦显微镜的关键区别。系统通过发射快速连续脉冲来提高同步吸收概率<416>2</416>。当激光聚焦时，光子空间密度增加<419>4</419>，这同时也提高了荧光团同时被激发的总体概率。多光子激发需要具备高峰值功率和飞秒级脉冲宽度的激光器。

图像外观

由于所有荧光信号均来自焦点处的微小体积，多光子显微镜可收集样本发出的全部荧光强度<422>5</422>。通过扫描激发激光获取样本各区域的荧光信号，从而构建完整视场图像。多光子吸收仅发生在焦体积内，因此可获得样本不同深度的高分辨率图像。由于局部激发特性避免了离焦光干扰，双光子显微镜在X/Y轴的分辨率与传统共聚焦显微镜相当<425>5</425>。而双/三光子显微技术在Z轴分辨率更优，因其三维空间内均能最小化离焦荧光<428>5</428>。这使得采集的截面区域更小，可分辨更精细结构（如<431>图3</431>所示）。

多数多光子显微镜系统采用光电倍增管(PMT)实现高灵敏度信号检测。该配置支持快速数据采集，适用于需要近实时反馈的应用场景。也可搭配CCD或CMOS探测器的机器视觉相机，通过附加光路获取样本的宽场图像<434>2</434>。

图 3：威斯康星大学麦迪逊分校光学与计算仪器实验室(LOCI)提供的多光子显微镜小鼠肿瘤图像<441>6</441>。

技术详细信息

图4描述了多光子显微镜的典型布局。多光子系统中包含多种光学元件。组成多光子系统的典型组件包括:

红外激光激发源采用钛蓝宝石激光器或超快光纤激光器等红外光源，发射飞秒级脉冲激光，其峰值辐照度足以诱发样本的多光子吸收。虽然钛蓝宝石激光器成本较高曾限制该技术应用，但新型低成本光纤激光器已改善此状况。
这些反射镜采用特殊介质膜层设计，既保证工作波段高反射率，又实现GDD最小化。二向色低GDD反射镜用于分离不同荧光波长的发射信号，低GDD扫描反射镜负责将发射荧光导向探测器。
二向色滤光片专门分离激发与发射波长。
无物镜 荧光随后通过物镜重新准直，并传输至探测器。多光子显微镜专用物镜通常具备以下特性：高数值孔径(NA)、高放大倍率、宽波段色差校正能力、长工作距离。
通过扫描不同焦平面并将图像三维重构，可生成立体影像。

图4：多光子显微镜系统的典型原理图。

多光子显微镜的应用

应用1：大脑成像

多光子显微技术使研究人员能够实现前所未有的脑组织深层成像。通过三光子技术，科学家可对海马体进行深层成像，揭示大脑神经元生成机制<472>8</472>。该技术支持<475>活体成像</475>，对多种病理诊断具有重要价值。在小鼠实验中，多光子成像被用于研究神经元和星形胶质细胞在阿尔茨海默病发展中的功能影响。活体成像使科学家能更深入理解该疾病的发病机理。借助多光子显微镜观测大脑，研究人员可探索疾病发展过程并开发更优诊疗方案<478>9</478>。

应用二：视网膜成像

多光子显微技术已成功应用于视网膜成像。传统视网膜成像方法因眼球光学像差无法观测亚细胞结构<481>7</481>。由于视网膜属于中枢神经系统，其成像既可诊断眼疾，也能识别脑退行性疾病。该技术为阿尔茨海默病和多发性硬化症等疾病的早期诊断提供线索。多光子显微术特别适合眼部成像，因其近红外激光既不会干扰视觉刺激，又能被眼组织高效透射<484>7</484>。高空间分辨率特性使其能精准评估眼部结构并解析疾病机制。

与其他显微技术的对比<487>6</487>

技术	分辨率	样本大小	相对成本	照相
共聚焦显微镜	µm	µm	$$	是
多光子显微镜	µm	mm	$$$	更少
光片荧光显微镜	µm	>cm	$	最少

Edmund Optics®的多光子显微镜

Edmund Optics®为多光子显微镜应用提供各种光学元件,包括低群延迟分散(GDD)镜面，滤光片，物镜，偏振器和光栅。随着多光子显微技术应用领域的持续扩展，我们正不断新增适配该系统的光学组件。

低 GDD 反射镜

专为超快光束控制设计，具有高反射率特性
提供IBS镀膜选项，实现低散射与低吸收
高激光损伤阈值选项
在设计波长范围内 GDD 低至 ±20fs²

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超快增强型银镀膜激光反射镜

在600–1000nm或800–1150nm时，反射率>99%
低群延迟色散（低至 0±20fs）2
非常适用于 Ti:sapphire 和 Yb:doped 超激光器
提供标准英制尺寸

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超快创新脉冲压缩镜组

高负群延迟色散
非常适合超快脉冲压缩
适用于常见波长的各种镀膜
来自超快创新的行业领先激光光学器件

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低 GDD 二向色性短波通超快滤光片

厚度更薄，可实现很低的 GDD
透射和反射范围广
超快激光应用的理想选择
运用内部计量技术控制 GDD 规格

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超快薄膜偏振片

非常适用于 Ti:sapphire 和 Yb:doped 超快激光器
已针对 45° AOI 的 S 偏振-和 P -偏振分离进行优化
在 DWL 具有 1000:1 的高消光比

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奥林巴斯（Olympus）水浸物镜

水浸物镜，放大倍数范围为10至40倍
显示从高透射系数到频谱近红外区域的平面图像
非常适用于组织和标本(如脑组织)的荧光成像

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Olympus X 系列扩展型复消色差物镜

高达1.45的高数值孔径(NA)
色差校正范围为400 - 1000nm
较大视野上的均匀图像平面度

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三丰(Mitutoyo) 远场校正长工作距离物镜

工作距离长
明场检测
高质量平场复消色差设计
整个视场的平坦成像面

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反射物镜

长工作距离，实现简单的系统集成
主动校准，确保卓越性能
190nm 至 11μm 的超宽光谱带，无色差
衍射-极限透射传输波前为 λ/14 RMS

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反射式衍射光栅

各种直纹和全息设计
槽间距公差小于0.05%的高精度选项
提供多种格栅类型的定制尺寸

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参考文献：

Allen，John R."光片荧光显微镜。"Nikon, https://www.microscopyu.com/techniques/light-sheet/light-sheet-fluorescence-microscopy
活塞，David W.等"多光子显微镜"。Nikon, https://www.microscopyu.com/techniques/multi-photon/multiphoton-microscopy。
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Davidson，Michael W.和David W. Piston。"多光子荧光显微镜简介。"Olympus Scientific Solutions Americas Corp.，https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/fluorescence/multiphoton/multiphotonintro/
Wendt, Kristy."多光子显微镜和第二次谐波生成。"光学和计算仪器实验室，威斯康星大学，麦迪逊，https://loci.wisc.edu/research/two-photon。
Qin, Zhongya, 等人。"自适应光学双光子显微镜可在体内实现接近衍射限制和功能性视网膜成像。"灯光：Sciences Applications, https://www.nature.com/articles/s41377-020-0317-9
May, Mike."揭示深层组织：多光子显微镜。"Science Magazine, https://www.sciencemag.org/features/2019/03/shedding-light-deep-tissue-multiphoton-microscopy。
Kelly, Patricia et al."阿尔茨海默氏病中的星形细胞结构和功能的两种体内光子成像。"Aging Neurosci，https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnagi.2018.00219/full
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