光片显微镜

作者：Maura Francis, Cory Boone, Jaclyn Wycoff

光片荧光显微镜（LSFM，也称选择性平面照明显微镜（SPIM））是一种中高分辨率的荧光显微镜方法，能够以高速捕捉图像。它非常适合于成像三维生物样本的多个深度，称为光学切片。激光光片被聚焦成二维平面，通常通过一个圆柱透镜来实现，只照亮样本的薄切片并激发荧光，从而减少光毒性和样本损伤 (图1).

图 1: 光片荧光显微技术(LSFM)通过二维平面对三维样本进行荧光激发，其激发区域体积小于传统荧光技术。该技术显著降低光毒性，减少对敏感生物样本的损伤。¹

传统落射式荧光显微镜会激发更大样本区域。激发光沿轴向(z轴)穿透样本时，会在焦平面内外同时激发荧光¹，这种离焦荧光会干扰焦平面信号的准确检测。

工作原理

在荧光或共聚焦显微镜中，激发照明与成像物镜共享同一光路。而光片荧光显微镜(LSFM)将照明光源分离，通常与检测光路垂直²。LSFM系统主要分为平面光片型与扫描光片型¹。本指南重点讨论平面光片构型——通过柱面镜与高斯光束的组合产生平面激光光片²。柱面镜将原本圆形的光束压平，形成平行于焦平面的薄片光²。由于一次性捕获整个平面，其成像速度远超传统单点聚焦技术。这正是多光子显微技术的主要劣势——其成像可能需要数小时，而LSFM仅需几分钟²。但LSFM海量数据的处理也带来挑战¹。LSFM可与多光子技术联用，提升成像深度与空间分辨率³。LSFM的另一缺点是使用多物镜时光路校准复杂。

LSFM主要用于生物样本成像，支持活体观测。得益于激光光片的穿透特性，该技术可对毫米级尺寸的光学透明样本进行成像。虽然其他技术可能提供更高分辨率，但光片荧光显微技术(LSFM)具有样本光损伤低的优势。在需要观察细胞运动和动态过程的应用中，LSFM能够快速捕获大视野图像³。该技术可用于长时间三维动态观测⁴，但必须保持光学稳定性以获得成功的时序成像结果。温度波动会导致样本位移，因此时序成像不太适合活体样本观测，因其可能在成像过程中发生移动。

光片显微镜的主要优势均源于其平面照明特性。传统显微技术难以在厚样本的整个成像区域保持光照强度的一致性。对厚样本成像时，通常会观察到沿焦平面方向的光强衰减现象。当样本含有不透光结构时，这种衰减效应会更加显著。此时会出现条纹阴影效应——样本特征呈现拖影状，并伴随分辨率下降¹。光片荧光显微技术(LSFM)通过在样本两侧设置双光源，可有效补偿这种光衰减²。

图像表现差异

图 2, 直观展示了传统荧光显微技术与LSFM在照明方式上差异所导致的成像效果对比。

图2：强照明还导致息肉收缩反应。高强度照明还会导致息肉收缩。相比之下，埃塞克斯大学开发的LSFM系统可以完全消除离焦荧光干扰，采用温和照明使息肉完全舒展成像。

图2：使用传统荧光显微镜成像的息肉图像包含显著的离焦平面荧光背景噪声。高强度照明还会导致息肉收缩。相比之下，埃塞克斯大学开发的LSFM系统可以完全消除离焦荧光干扰，采用温和照明使息肉完全舒展成像。^{1, 4}。

图2：传统荧光显微镜拍摄的息肉图像存在明显的离焦荧光背景噪声。高强度照明还会导致息肉收缩反应。相比之下，埃塞克斯大学开发的LSFM系统可以完全消除离焦荧光干扰，采用温和照明使息肉完全舒展成像。^1,4。

光片荧光显微技术(LSFM)通过多组件协同提升图像质量：通过平移和旋转样本，可获取平行于焦平面的多薄层图像；或直接扫描光片穿过样本²。从不同视角采集同一样本区域的图像，经融合处理后能显著提升分辨率。照明物镜的数值孔径(NA)直接影响分辨率²。NA决定了物镜收集或发射光线的最大角度。高NA物镜可实现更优的衍射极限分辨率，但会缩小样本可视区域（即视场FOV）。然而小视场不利于厚样本成像，因为扫描特定区域需要更长时间。光片荧光显微镜(LSFM)可对数十毫米厚的样本成像且无照明衰减导致的图像劣化，其成像厚度比典型共聚焦显微镜增加约9mm¹。这一特性对荧光厚样本成像尤为重要，因为传统技术中焦区外的二次荧光会干扰成像。光片荧光显微技术(LSFM)通过选择性平面照明规避了该问题——仅激发焦平面，避免多余荧光干扰。

当采用薄腰高斯光束生成光片时，可以提升轴向分辨率。但会缩短沿照明光轴方向的传播距离。这将导致视场(FOV)缩小。反之，采用厚腰高斯光束可增加传播距离，但会降低分辨率^4<。不过，这种方式也可能增加样本的光损伤风险。

技术详细信息

尽管光片荧光显微镜(LSFM)系统存在多种构型，图3展示了一种典型布局：使用单一激光光源照明，并通过扫描振镜使激光束扫过静止样本。系统可通过二向色滤光片（也称分光镜）整合多激光源与探测器，实现多光束耦合。

图 3：LSFM系统的简化原理图。⁵

激光激发源： 向系统发射高斯激光束并聚焦至样本可通过二向色滤光片耦合多激光源，统一导向扫描振镜.³
扫描振镜： 调控激光束位置，决定其与样本的接触点
扩束镜： 在光束到达柱面镜前扩大其直径。该器件确保光片窄维度聚焦更紧密
柱面镜： 单向聚焦光束，使其通过照明物镜后在样本处形成薄光片。
照明物镜： 垂直于探测器。该物镜通过其数值孔径(NA)决定成像视场(FOV)及样本受光量。为减少光衰减，有时会在样本两侧配置双照明物镜和激光光路。
样本固定装置： 作为关键组件直接决定LSFM系统的实施方案。样本固定可采用以下方式：凝胶包埋、钩挂固定、液体浸没、盖玻片装载。²
探测物镜： 收集系统出射光进行分析。通常优选高NA设计以提升分辨率，液态样本多采用水浸物镜
滤光片： 陷波/长通/带通滤光片用于消除样本散射的激光。
套筒透镜： 在探测器上形成图像。当使用多个探测器时，二向色滤光片可在探测物镜后分离不同波长。每个波长将拥有独立的光路配置：陷波滤光片、套筒透镜、专用探测器。
探测器： 用于图像采集。
三维旋转平移台(xyzθ)： 支持XYZ轴平移及旋转运动。可是的系统可以通过多视角图像融合提升分辨率。

光片荧光显微镜的应用

应用1：跟踪胚胎发育(胚胎发育)

光片荧光显微镜(LSFM)最常见的应用之一是追踪人类和动物胚胎的发育过程，这一过程被称为胚胎发生。¹ 胚胎会被标记上荧光标记物，这些标记物能够被LSFM系统的光片所激发。这使得科学家能够追踪发育中胚胎的细胞生长情况。软件实现可实现自动化的细胞追踪功能。LSFM凭借其大视场和高成像速度，在胚胎及其他大型活体样本成像方面具有显著优势。

应用 2: 耳鼻喉科（耳部与听觉研究）

光片荧光显微镜(LSFM)同样成为耳鼻喉科研究的关键技术，因其特别适用于中耳及内耳结构的成像。¹ 该技术使研究人员能建立比以往模型更精细的耳部结构三维模型。

与其他显微镜技术的比较⁶

技术	分辨率	样本大小	相对成本	照相
共聚焦显微镜	µm	µm	$$	是
多光子显微镜阅读	µm	mm	$$$	更少
光片荧光显微镜	µm	>cm	$	最少

Edmund Optics®的光片荧光显微镜

Edmund Optics®为LSFM应用提供广泛的光学元件,包括扩束镜，圆柱透镜，显微镜物镜和陷波滤光片。为适应该应用领域的技术发展，我们持续为这些系统增添理想的光学组件。

扩束镜

用于在扫描镜后扩展激发光束
从 257nm 到 3µm 的各种激光线和宽带镀膜
提供发散角和放大倍数调整的设计
针对高能量光学组装件的无内焦点且无鬼影设计

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激光级柱面透镜

聚焦一个尺寸的照明光束形成光片
常见激光器的激光线和宽带镀膜
激光谱线镀膜提供<0.25%的反射率
采用熔融石英基底

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奥林巴斯（Olympus）水浸物镜

倍率范围从 10 至 40X
显示从高透射系数到频谱近红外区域的平面图像
非常适用于组织和标本(如脑组织)的荧光成像

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Olympus X 系列扩展型复消色差物镜

高达1.45的高数值孔径(NA)
色差校正范围为400 - 1000nm
较大视野上的均匀图像平面度

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三丰(Mitutoyo) 远场校正长工作距离物镜

明场检测
高质量平场复消色差设计
整个视场的平坦成像面

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反射物镜

长工作距离，实现简单的系统集成
主动校准，确保卓越性能
190nm 至 11μm 的超宽光谱带，无色差
衍射-极限透射传输波前为 λ/14 RMS

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荧光带通滤光片

适用于常见荧光团的常见波长
激发和发射滤光片可供选择
透过率 >93%
截止 >OD 6，距离带宽边缘<3%。
另有荧光滤光片套件和预安装的荧光滤光片立方体组件可供选择

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荧光二向色性滤光片

非常适合荧光或高光谱成像
从反射到透射的锐利过渡
扩展的反射带和透射带
也提供高性能荧光二向色滤光片

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陷波滤光片

阻止可能散射样品的任何激发波长
OD 4.0 和 OD 6.0选项
透射范围广

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ScannerMAX Saturn 检流式振镜

3、5 和 10 毫米反射镜光孔
单轴和双轴版本
用以成像和投影系统的高性能扫描系统。

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相干（Coherent^®高性能OBIS™ LX/LS 激光系统

适用于所有波长选项的相同紧凑型设计
具有模拟和数字调制功能的集成控制电子设备
具有卓越光束质量的圆形光束
Coherent^® 高性能 OBIS ™ LX/LS 光纤激光系统

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燕尾槽光学导轨系统

提供多种托架长度和安装孔选项
薄型设计，运动流畅
提高稳定性和<1mrad直线准确度

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光学平台和面包板

工作台板，复合面包板和实验室工作台
英制和公制两种规格选项
提供各种面包板附件和光机器件

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参考文献：

Allen, J. R."光片荧光显微镜."Nikon, https://www.microscopyu.com/techniques/light-sheet/light-sheet-fluorescence-microscopy
Pasche-Drews，M."应用说明：光片显微镜。Teledyne Photometrics, https://www.photometrics.com/applications/appnotes/light-sheet-microscopy。
Albert-Smet, I. et al."光片显微镜在微器件中的应用。"前部。Neuroant. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnana.2019.00001/full
Schelkanova, I., et al.(2017).实时荧光成像中的光毒性评估。Nature Methods，14 (7)，657-661。Doi：10.1038/nmeth.4344.
Olarte, O. E., et al.(2018).光片显微镜:一个教程。Advances in Optics and Photonics, 10(1), 111-179. doi.org/10.1364/AOP.10.000111
Santi, P. A.(2011).光片荧光显微镜。J Histochem Cytochem, 59(2), 129-138. Doi: 10.1369/0022155410394857