共聚焦显微镜

作者：Maura Francis, Cory Boone, Jaclyn Wycoff

共聚焦显微镜是一种<381>荧光显微镜技术</381>，其采用激光激发荧光标记物的荧光信号，用于标记样本的不同组分。荧光显微镜主要用于对荧光标记的细胞和组织进行成像。<384>1</384> 共聚焦技术与传统落射式荧光显微镜的区别在于：对厚样本成像时具有更高分辨率、通过空间滤波消除离焦眩光、降低光毒性对样本的光损伤。

与传统显微镜使用非相干钨灯或汞灯光源不同，共聚焦显微镜采用激光照明样本。<387>1</387> 该系统通过扫描激光在不同焦平面的位置，可获取样本不同深度的光学切片图像。<390>1</390> 光学切片技术无需物理切片即可实现活体样本成像。小区域照明技术通过显著降低光毒性效应，有助于延长样本活性。传统照明技术使用的光量难以保证成像样本的活性，这在捕捉生物过程时尤为关键。<393>1</393>

图像表现

相较于传统荧光显微镜图像，共聚焦系统获得的图像在轴向和横向分辨率上仅有边际提升，但其针孔组件实现的空间滤波可有效阻挡离焦荧光，从而获得更精细的图像（<396>图1</396>）。<399>2</399> 由于背景噪声降低和信噪比提升，图像对比度较传统方法有明显改善。传统技术中，样本相邻区域发出的荧光会干扰成像焦平面。<402>1</402> 当样本厚度超过两微米时，无法区分非焦平面荧光的问题尤为突出。<405>1</405> 共聚焦显微镜通过空间滤波技术阻挡离焦光，有效解决了这一难题。<408>2</408>共聚焦与多光子显微镜在X/Y轴分辨率相当，但多光子技术在Z轴（深度）分辨率更优。相比多光子技术，共聚焦仅使用单光子激发荧光染料，可能导致更多光散射且成像深度有限。共聚焦通常使用可见光谱，其在生物组织中的散射和吸收也较更长波长的光更强，从而限制了样本穿透深度。尽管如此，共聚焦技术相比传统宽场技术仍具有显著的分辨率优势，可视为连接经典宽场技术与先进超分辨技术的桥梁。共聚焦显微镜非常适用于二维细胞培养物成像，而多光子与光片显微镜则在三维样本成像方面更具优势。

图1：使用共聚焦显微镜捕获的原生质体图像(左)，比使用传统EPI荧光显微镜捕获的类似尺寸的微球图像更精细聚焦。

技术详细信息

图2描述了共聚焦显微镜的典型布局,其中包括四个关键组件:

可阻挡所有非物镜焦平面的杂散光干扰成像<428>2</428>
该设计实现了三维数据的自动采集，便于构建3D图像<434>2</434>
针对活体样本常处的含水介质，多采用水镜或油镜设计以校正折射率失配。厚样本及3D成像/光学切片需配备长工作距离物镜。

图2：典型共聚焦显微镜系统示意图

与其他显微镜技术的比较³

技术	分辨率	样本大小	相对成本	照相
共聚焦显微镜	µm	µm	$$	是
多光子显微镜阅读	µm	毫米	$$$	更少
光片荧光显微镜	µm	>厘米	$	最少

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参考文献：

Paddock, Stephen W., et al."介绍性共焦点概念。"Nikon, https://www.microscopyu.com/techniques/confocal/introductory-confocal-concepts。
Fellers, Thomas J., and Michael W. Davidson."共焦显微镜简介。"Olympus Scientific Solutions Americas Corp.，https://www.olympus-lifescience.com/ru/microscope-resource/primer/techniques/confocal/confocalintro/。
Santi, P. A.(2011).光片荧光显微镜。J Histochem Cytochem, 59(2), 129-138. Doi: 10.1369/0022155410394857.