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了解显微镜和物镜
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了解显微镜和物镜

显微镜组件 | 主要概念和规格 | 光学显微应用示例

显微镜是一种光学仪器,主要用于将物体成像反射到人眼或视频设备。最早的显微镜是由两个组件制作而成的简单显微镜,将肉眼所看不见的物体放大成像。在整个显微镜历史中,其设计已从简单的两个组件发展成为由多个透镜滤光片偏振片分光器、传感器、照明源,以及一系列其他组件的组合构成的精密显微镜。要深入了解这些复杂光学仪器,就必须先了解显微镜的组件、主要概念和规格及其应用。

显微镜组件

复合式显微镜是由多个透镜的组合构成的一种光学仪器。其工作原理与简单放大镜类似,那就是利用单片透镜将微小物体放大成像,使人们能够透过肉眼观察到微小物体的微细结构。简单放大镜的工作原理是将物体放置于单片透镜的焦距内,以此获得该物体放大的虚像。中续透镜系统在显微镜中取代了单片透镜,转而让物镜目镜协同工作,并根据应用的不同,将物体成像反射到人眼或传感器中。显微镜中有两个组件负责提高整体系统的放大倍率,这两个组件是物镜和目镜。物镜是最靠近物体的光学元件,其作用是得到物体放大的实像,并将其反射到目镜。物镜是显微镜最重要的部分,用于产生基线放大倍率。目镜则是最靠近人眼或传感器的光学元件,其作用是将物镜所成的实像进一步放大,形成一虚像。目镜的放大倍率通常为10倍,但有时会介于1到30倍之间。图1展示了复合式显微镜的组件。另外,方程式1说明了显微镜整体系统放大倍率的计算方法。

Components of a Compound Microscope
图1: 复合式显微镜组件

 

(1)$$ \text{Magnification} _{\text{System}} = \text{Magnification} _{\text{Objective}} \times \text{Magnification} _{\text{Eyepiece}} $$

 

目镜

目镜在显微镜发明之初扮演了重要角色,因为当时目镜是唯一一个能够让人们透过肉眼观察微小物体细节的光学元件。今天,人们是使用模拟相机或数码相机,将物体成像反射到监视器或屏幕上。显微镜目镜通常是由场透镜和目透镜组合而成,具备多种设计,每种设计所提供的视场都比单片透镜所产生的视场来得更大。要了解如何选择合适的目镜设计,请参阅选择正确的目镜

照明

与选择正确的目镜物镜一样,照明同样也是显微镜中的重要部分。选择正确照明对在实验中获得决定性的结论起了关键作用。在决定采用哪种类型的照明设置之前,首先要考虑的是应用设置、所要观察的物体,以及预期的结果。

许多显微镜都会选择采用背光源照明,而不是传统的直接照明,因为后者通常会导致物体成像过度饱和。显微镜应用所采用的特定背光源照明类型为Koehler照明。在Koehler照明中,照明源(如灯泡)的入射光发射出充足光线,从后面照亮物体(图2)。它配有两种凸透镜,那就是:聚光透镜和集光透镜。它的设计主要用于在物体平面和成像平面上提供亮度足够且均匀的照明,让物镜得到的物体实像能够通过目镜进行反射。这是非常重要的,因为这能确保用户不会将灯泡的灯丝放大成像。由于背光源照明是从后面照亮物体,因此这种现象亦称为亮场照明。

Koehler Illumination Setup
图2: Koehler照明设置

 

要采用亮场照明来观察物体,就必须改变物体的不透明度。如果物体的不透明度没有改变,照明源会在物体周围产生模糊的黑点。最终得到的成像是部分物体和光源之间的相对反差。在大部分情况下,除非物体具有极高的透明度,否则只要有足够的清晰度或分辨率,人们就能够透过最终产生的成像看见物体的每个部分。当物体的透明度造成显微镜无法利用亮场照明来观察物体的细节时,可以转向采用暗场照明。

在采用暗场照明的显微镜中,光线无法直接进入物镜,而是倾斜地照射在物体上。但要记住的重要一点是,光线仍然照亮着物体平面上的物体。暗场照明下所获得的成像在透明物体和光源之间形成强烈明暗对比度。显微镜设置中的暗场照明所产生的光源会形成一束倒立的光线,阻挡光源的中央光束,从而使光改变途径,倾斜地照射在物体上。图3展示了暗场照明的设置,该空心圆锥光线就是物镜的数值孔径。相比较之下,亮场照明设置中没有任何光线被阻挡。暗场照明的设计能够让光线照亮物体,但是却无法进入光学系统,因此它适用于观察透明物体。

Darkfield Illumination Setup
图3: 暗场照明设置

 

显微镜使用的第三种照明类型是落射照明。落射照明的光束是在物镜上方产生的。因此,物镜和落射照明光源可用于代替Koehler照明设置。落射照明设计的最大优势在于利用物镜来完成大部分的照明,因此它拥有紧凑的照明设计。图4展示了常用于荧光应用中的落射照明设置。有关荧光显微镜的更多信息,请参阅荧光显微镜的荧光团和滤光片

Epi-Illumination Setup
图4: 落射照明设置

 

物镜

物镜显微镜结构最为复杂的光学元件,由若干个透镜组合而成的一个透镜组,主要功能是使物体成一放大的实像。物镜的放大倍率通常介于2到200倍之间。物镜主要可以分为两大类:传统的折射物镜和反射物镜。每一大类进一步划分为以下两种类型:有限共轭无限共轭(远场校正)。要选择最合适的物镜,就必须了解每一大类物镜及其个别类型的优势。

物镜:折射式

折射物镜是最常用于显微镜中的物镜类别。当光线通过显微镜时,物镜的折射式设计能让光学元件将光线折射或弯曲。每个光学元件的表面都镀有增透膜,其作用是减少背部反射,并改善整体光通量。折射物镜常用于需要极高分辨率的机器视觉应用中。折射物镜具有多种类型,每种类型都使用不同的光学配置。折射物镜的设计范围可以从配有两个元件的消色差物镜(元件分别为消色差透镜和弯月透镜),到配有十五个元件的平场复消色差物镜(图5)。平场复消色差物镜是设计最为复杂的高端物镜,物镜本身能够完成色差校正和平场校正。

Apochromatic vs. Achromatic Objective Design
图5: 复消色差物镜(左)与消色差物镜(右)设计

 

物镜:反射式

反射物镜是一种具有反射或镜面设计的物镜。尽管反射物镜的大部分校正程度均与折射物镜相同,但在选择物镜时,它依然常为人们所忽略。反射物镜由第一和第二镜像系统组合而成(图6),其作用为将受观察物体放大成像,然后将该成像反射到目镜中。Edmund Optics®提供了各种不同设计的反射物镜,其中最受欢迎的设计为Schwarzschild反射物镜。由于光线是通过金属表面进行反射,而不是通过玻璃表面进行折射,所以反射物镜不具备如折射物镜所面对的像差问题,因此无需采用额外设计来校正像差。另外,由于反射物镜的表面主要材料为反射镜膜而非玻璃基片,因此它能够提供较高的光效以及为成像细节提供更高的分辨率。反射物镜的另一优势是其工作距离长,比起传统的折射物镜,其所采用的镜面能够在紫外区域和红外区域的光谱范围内工作。

Anatomy of a Reflective Objective
图6: 剖析反射物镜

 

主要概念和规格

物镜主体上列出了大部分显微镜物镜的规格,其中包括:物镜设计/标准、放大倍率、数值孔径、工作距离、透镜-成像间距,以及盖玻片厚度校正。图7显示了显微镜物镜规格的相关说明。由于物镜主体上已列出了所有规格,因此用户在为某个应用安装数个物镜时,就可以轻易地了解到所使用物镜的相关功能。对于如焦距、视场、波长设计等其他规格,用户则可以轻易计算得出,或者向供应商或制造商索取有关规格。

Typical Transmissive Microscope Objective
图7: 典型投射性显微镜物镜

物镜标准

如果物镜所采用的标准为简单显微镜标准(如DIN或JIS标准),那么其主体就会列出系统所需的物镜规格。大部分复合式显微镜设计标准均采用德国工业标准(Deutsche Industrie Norm,简称DIN)。DIN标准的显微镜物镜法兰和目镜法兰之间距离为160mm(图8)。除了DIN标准外,同时也具备采用日本工业标准(Japanese Industrial Standard,简称JIS)的显微镜。JIS标准的显微镜物镜法兰和目镜法兰之间的距离为170mm(图9)。在选择合适物镜和目镜时,用户必须将这两个透镜的法兰距离考虑在内,从而确保物镜将物体放大成像后,正确地将该成像反射到目镜中。虽然DIN标准和JIS标准的显微镜具有不同的成像距离,但是此距离差异并不会对显微镜的光学性能产生任何影响,并且都能够提供相同高质量的成像。另外,符合这两项标准的显微镜均采用相同的0.7965" x 36TPI RMS安装螺纹。

DIN和JIS标准长期以来一直是人们选择经典复合式显微镜时的考虑因素。一些显微镜制造商倾向于根据光学属性来列出管透镜长度,而非机械属性。由于目镜是在中间成像平面上使物体成像,因此这将改变DIN标准显微镜的管透镜长度至150mm(图8)。最后,用户也可以通过物镜特别列出的维度来了解管透镜长度:齐焦距离(PD)。齐焦距离是物镜法兰和受观察物体之间的距离。DIN物镜的标准齐焦距离为45mm,而JIS物镜的标准齐焦距离则为36mm(图8和9)。

DIN Standard
图8: DIN标准
JIS Standard
图9: JIS标准

 

放大倍率

目镜物镜都具有放大倍率,对显微镜整体系统的放大倍率起着非常重要的作用。放大倍率通常是以一个数值和“X”表示。大部分物镜的主体周围都配有色码环,用于表示物镜的放大倍率(图7)。举例来说,黄色表示的放大倍率为10倍。

数值孔径

物镜的数值孔径(NA)是焦距和入瞳直径的函数。数值孔径大的物镜有时需要在受观察物体和物镜前端之间使用浸镜油。这是因为空气中能够实现的最高数值孔径为1(相应光线角度为90°)。要获得较大的角度并提高进入物镜的光线数量(方程式2),就需要使用油浸物镜(折射率通常为1.5)来改变受观察物体和物镜之间的折射率。数值孔径大的物镜和浸镜油的结合使用提供了一个简单的解决方案,使用户无需花费更多的金钱来选择使用其他物镜。

(2)$$ \text{NA} = n \cdot \sin{\theta} $$

视场

视场代表着显微镜系统能够观察到物体的范围。视场的大小是由物镜的放大倍率来决定的。在配有目镜和物镜的显微镜系统中,其物镜的视场是由目镜放大的,从而使用户能够通过目镜观察到物体。然而,在相机物镜系统中,视场则是传递到相机传感器中。相机传感器是矩形的,所以它只能接收到物镜全视场中的部分成像。相比之下,人眼视网膜则可以看见全视场的整体成像。这就是为什么相机显微镜系统的视场通常都小于目镜显微镜系统的视场。方程式3和4可用于计算上述系统的视场。

(3)$$ \text{Field of View}_{\text{Camera−Objective}} = \frac{\text{Camera Sensor Size}}{\text{Magnification}_{\text{Objective}}} $$
(4)$$ \text{Field of View}_{\text{Eyepiece−Objective}} = \frac{\text{Field Stop}_{\text{Eyepiece}}}{\text{Magnification}_{\text{Objective}}} $$

盖玻片厚度

当使用显微镜观察带有液体的标本(如细菌、细胞培养物、血液等)时,应将这些组织或切片放在盖玻片上,以免污染受观察物体和显微镜组件。盖玻片又称为显微镜用盖片玻璃,它能够改变光线从物体到物镜的折射。因此,要获得高质量的成像,就必须对物镜进行正确的光学校正。这就是为什么备有一系列的盖玻片厚度,以用于优化物镜。盖玻片厚度通常是标识在无穷符号之后(即表示物镜是有限共轭物镜,或是远场校正物镜),厚度范围介于0(无盖玻片校正)至0.17mm之间。

像差校正

显微镜系统性能的高低取决于物镜目镜的质量。在选择合适的物镜类型时,除了放大倍率和设计复杂性之外,了解正确的像差校正也是极为重要的。像差校正(如消色差、复消色差、平场、半平场)是指物镜本身能够让用户轻易地看见物镜的设计问题。色差校正通常可分为两类:消色差和复消色差。消色差物镜是结构简单且经济实用的一种物镜。除了可校正绿色波长中的球差之外,它的设计主要用于校正红色波长和蓝色波长中的色差。但是,它无法消除其他波长的色差以及不具备平场校正的缺点导致其物镜性能低下。相比之下,精密度高的复消色差物镜则能够在三种波长区域(红色、蓝色和黄色)中校正色差。此外,它们也能够提供二到三种波长的球差校正,而且通常具有较高的数值孔径和较长的工作距离。复消色差物镜非常适合用于白光应用中,而消色差透镜则是单色光应用的最佳选择。然而,这两种物镜都具有一个显著的缺点,那就是当物镜放大倍率提高时,就会出现畸变和场曲问题。因此,在选择物镜时,应将整体显微镜系统性能考虑在内,而并非只考虑到物镜本身的性能。

平场物镜,也称为平面物镜、半平场物镜、半平面物镜或微平面物镜,都是用于校正场曲的物镜。场曲是一种像差。当离轴成像无法在平坦的成像平面上集中时,光轴就会出现偏离,进而导致成像变得模糊。图10展示了消色差物镜、半平场物镜和平场物镜依据中心轴径向距离计算得出的视场平坦度。使用消色差物镜校正场曲之下,成像中心具有65%的平面视场。平场物镜能够提供更好的平场校正,使成像具有90%的平面视场。半平场物镜的校正性能介于上述两种物镜之间,能够使成像获得80%的平面视场。

Flat Field Correction
图10:平场校正:消色差物镜65%(左)、半平场物镜80%(中)、平场物镜90%(右)

有限共轭

在有限共轭光学设计中,光源(不在无穷远)是集中在一个点上(图11)。受观察物体在显微镜中是由物镜放大成像的,然后物镜会将成像反射到目镜或传感器(若使用相机)中。整个显微镜系统透镜之间的距离是根据DIN或JIS标准而定的,所有有限共轭显微镜均采用其中一个标准。有限共轭物镜普遍用于普通显微镜中。此外,有限共轭设计常用于成本和简单设计为主要考量的应用中。

Simplified Finite Conjugate Microscope Design
图11: 简单的有限共轭显微镜设计

 

无限共轭(远场校正)

在无限共轭(又称为远场校正)光学设计中,位于无穷远的光源是集中在一个小点上。该小点是物镜中的受观察物体,并且无穷远朝向目镜相机的传感器(图12)。这种设计新颖的显微镜主要是利用物体和目镜之间的额外管透镜来产生成像。虽然此显微镜的结构比有限共轭物镜更为复杂,但是它却允许用户将滤光片偏振片分光器等光学组件装入显微镜中。因此,额外的成像分析和外推能够在此设计复杂的显微镜中执行。举例来说,在物镜和管透镜之间添加滤光片能让用户观察到光源的特定波长,或是阻挡会对显微镜设置带来干扰的多余波长。荧光显微镜应用就是采用这种设计类型。无限共轭设计的另一优势是其放大倍率能够随特定应用需求而变化。物镜放大倍率是指管透镜焦距与物镜焦距之间的比率(方程式5),管透镜焦距的增长或缩短都会改变物镜的放大倍率。一般上,管透镜是焦距为200mm的消色差透镜,但是也可以采用其他焦距的透镜,进而帮助定制显微镜系统的总放大倍率。如果所用物镜为无线共轭物镜,物镜主体上会出现无穷远符号。

Simplified Infinite Conjugate Microscope Design
图12: 简单的无限共轭(远场校正)显微镜设计
(5)$$ \text{Magnification}_{\text{Objective}} = \frac{\text{Focal Length}_{\text{Tube Lens}}}{\text{Focal Length}_{\text{Objective}}} $$

>光学显微应用示例

要了解显微镜组件如何能够与各种光学、成像和光电产品相整合,请考虑使用以下光学显微应用:荧光显微镜应用和激光烧蚀应用。每种应用都具有独特的设置,能够与显微镜的组件协同工作。

荧光显微镜

荧光团是一种荧光染色剂,用于为蛋白、组织和细胞添加荧光标签以供检测或研究。荧光团能够吸收一个波长的光,然后发射(发出荧光)另一波长的光。典型的荧光显微镜设置会使用三种滤光片:激发滤光片、发射滤光片和二向色性滤光片。每个荧光团具有特定的吸收带波长或激发带波长,而激发滤光片只会透射特定范围的波长。荧光团一旦被激发后,就会发射其他范围的波长。发射滤光片只能用于透射发射波长。二向色性滤光片专为反射发射波长和透射激发波长而设计,其作用为隔开激发通道和发射通道。图13展示了典型的荧光成像设置。有关荧光显微镜的更多信息,请参阅荧光显微镜的荧光团和滤光片

Typical Fluorescence Microscope Setup
图13: 典型荧光显微镜设置

激光烧蚀应用

激光的两个常见用途是:(1)将材料加热并镀到基片上,以及(2)烧蚀基片材料以使其脱落。激光烧蚀系统使用显微镜组件的原因是它需要进行精密的激光光束操纵(如聚焦、折射、散射衰减等)。激光烧蚀设置通常会选择采用定制光学件,而非现成光学组件,以及专为系统精心设计的激光(图14)。激光在落射照明设计中的定位充分利用了显微镜物镜将光线聚焦在物体平面上的能力,进而产生了尺寸较小的光斑,并减少像差。另外,用户还能够通过目镜观察到激光的位置,并确保系统操作正常。在激光烧蚀系统中,滤光片的使用是必要的,因为这能保护用户的眼睛免受激光伤害。激光烧蚀设置常用于医疗和生物应用中,因为它们能够提供比传统手术方法更高的精密度。

Typical Laser Ablation Setup
图14: 典型激光烧蚀设置

显微镜物镜是具有多种用途的复杂光学系统。它们的应用不再仅仅局限于生物应用中(如在生物课上用于观察颊上皮细胞),相反地,用户可以使用这些光学件来观察荧光团中的发射波长、分析加工镜片上的5μm缺陷、监督基片材料脱落的烧蚀过程,以及与各种光学、成像和光电产品搭配使用。深入了解显微镜各个组成部件的重要性及其规格可帮助用户选择出最合适的显微镜系统,从而在实验中获得最佳结果。

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