荧光显微镜：内置了照明和滤光片用于成像

作者: Stephan Briggs

基本设置 | 建议的组件

相机技术的发展进步使生物应用和工业应用中的显微镜发生了革命性的变化。因此，生物学家或工程师再也无需耗费数小时使用目镜进行观察和不断地对焦。此外，当今的数字视频显微镜系统也简化了数据记录和数据分析的流程。更多有关此系统类型的一般信息，请参阅数字视频显微镜调整件设置。

要真正了解数字视频显微镜系统的好处，您可以考虑使用充分利用内置照明和滤光片的配置，以获得最佳对比度和发射量化。

荧光显微镜的基础

荧光显微镜非常适用于测量和分析各种光波长的吸收和激发。内置荧光显微镜设置利用平板分光器将照明器的光源转折至平行光学路径。从机械的角度来说，此设置的复杂程度低于其他数字视频显微镜系统，其设置就如图1所示。与大多数光学系统一样，此系统同样具备了传感器、光学组件以及受检测物体。基于本次讨论目的，此设置将采用#59-367 EO-3112C ½" CMOS彩色USB相机作为传感器，以及#59-877 10X EO M Plan Apo远场校正物镜和#54-774 MT-1配件管透镜作为光学组件。#54-774是所需的配件透镜以形成来自远场校正透镜的图像。受检测物体可以包括物体如生物样品、植物或昆虫、玻璃或金属材料，以进行检测或作为检测目标。

图1： 荧光显微镜的七元件远场校正数字视频显微镜系统

在数字视频显微镜系统（图1）中选择激发波长和发射波长时，滤光片的选择极为重要。随着更多光学滤光片的增加，此类型的设置通常又称为荧光显微镜（图2），同时也是高级技术如共焦、多光子以及Coherent反斯托克斯拉曼散射显微镜系统的重要支柱。更多有关此光学滤光片的信息，请参阅荧光显微镜的荧光团和滤光片。

用户可以通过阻断特定波长来使样本曝光于过量光源之下，特别是通过荧光显微镜成像的样本需要大量的激发能量，以发射量化数量的光源。高光密度的镀加硬膜滤光片和二向色性滤光片能够快速且轻易地阻断特定波长。二向色性滤光片和发射滤光片是系统中最重要的滤光片。二向色性滤光片反射的波长较短，通常能够激发荧光团，以及透射较长的发射波长。这两种光学滤光片相互配合使用下，能够防止非发射能量和杂散光透射到传感器。滤光片的重要参数包括了中心波长(CWL)、最小透射百分比、光密度(OD)和带宽，在某些情况下也被称为半峰全宽(FWHM)。更多有关滤光片的信息，请参阅光学滤光片。

图2： 用于荧光显微镜的滤光片基本布局

光学件和机械组件

要构建最精密的荧光显微镜设置，您需要一系列的光学件、成像组件和定位组件 。表1所展示的完整组件清单（又称为物料清单）详细地介绍了一系列建议的产品，并列出了产品编号及其数量，让您轻松方便地选择最合适的组件。

图3展示了使用表1列出的产品所构建的实际设置。此设置所使用的组件从上至下的顺序依次为#59-367 EO-3112C ½" CMOS彩色USB相机、#58-329和#55-743 C接口适配器以及其连接的#54-774 MT-1配件管透镜。物镜前和管透镜后之间的间距是平行光学路径，是远场校正系统的优势。用户可以在此光学路径中装入光学组件，且不会产生畸变或色差。在图3中，#56-6586组滤光片转轮组件可以固定数个带通发射滤光片，而二向色性分光器 则可以将白光源向下反射以产生内置照明，并在光源从物镜透射返回至传感器时净化多余的光源。最后，使用#59-877 10X EO M Plan Apo远场校正物镜以及一系列的机械组件 能够使样本处于最佳对焦位置。欲查看滤光片转轮组件和安装管透镜后设置的特写，请查看图4。

图3： 荧光显微镜设置样本

图4： 平行光学路径中滤光片转轮组件和带通滤光片特写

数字视频显微镜设置是检测工业和生物样本的强大光学工具。这些工具可以如用户所愿成为简单或复杂的系统，组件数量范围可从4个元件到12个元件。采用超过12个元件的系统通常具备复杂精细的过滤方法，并且需要使用精密的机械组件将光学滤光片放置于光学路径中。当有必要在相机物镜系统的光学路径中放置光学元件，特别是荧光显微镜应用时，七元件远场校正系统是最理想的选择。